Pendahuluan
Perkembangan teknologi biologi molekuler telah mendorong manusia mampu untuk mengembangkan inovasi-inovasi baru yang dapat mensejahterahkan ummat manusia secara umum. Salah satu teknologi yang berkembang dengan pesatnya adalah teknologi stem sel (sel punca) yakni suatu teknologi yang mampu menghasilkan sel/jaringan, atau bahkan organ baru yang dapat dipergunakan untuk mengganti sel/jaringan atau organ pada tubuh yang rusak (degeneratif).
Salah satu stem sel yang paling banyak diteliti saat ini adalah Embrionik Stem sel (ES), ES berasal dari sel-sel embrio (khususnya sel-sel pada Inner Cell Mass/ICM) pada tahap blastocit yang kemudian dapat diisolasi untuk dikultur menjadi stem cel dan dikembangkan menjadi sel/jaringan atau organ baru. Kemampuan sel atau sebagian tubuh dari suatu organisme untuk berkembang menjadi sel apa saja (pluripotensi) atau menghasilkan kembali satu individu baru (totipotensi) telah lama menarik perhatian para ilmuan biologi selama beberapa generasi. Pada tingkatan molekuler, kemampuan pluripotensi atau totipotensi dari suatu sel (stem sel) sangat terkait dengan suatu faktor transkripsi dan ekspresinya dalam menentukan apakah sel tersebut akan bersifat totipotent, pluripotent atau hanya unipotent. Salah satu faktor transkripsi yang berperan penting dalam proses ini adalah gen Oct-4, yang juga dapat berfungsi mengaktifkan atau menekan ekspresi dari beragam gen.
Oct-4 adalah salah satu gen dalam kelompok POU domain (Pit1-Oct Unc86) yang berfungsi untuk memediasi pengaturan transkripsi dari gen target yang diikatkan pada urutan octamer pada daerah promotor atau enhancer (Scholer HR, 1991; Pesce M et al, 2001). Oct-4 adalah anggota kelas V dari kelompok POU faktor transkripsi (Scholer HR et al, 1990, Pesce M et al, 1999), dan biasanya juga dikenal dengan nama Oct-3 (Okamoto K et al, 1990). Gen Oct-4 ini merupakan salah satu gen yang paling banyak dikarakterisasi oleh peneliti saat ini karena gen ini berhubungan dengan sifat pluripotent dari sel-sel embrionik (Mitalipov., et al, 2003). Sebagai salah satu faktor transkripsi Oct-4 mengatur ekspresi gen target dengan mengikatkannya pada motif oktamer 5’-ATGCAAAT-3’ yang ada pada daerah promotor atau enhancernya (Scholer HR, et al, 1991, Herr W, et al, 1995, Pesce M, et al, 2001).
Protein dari gen ini telah berhasil diisolasi dari beragam organisme (Herr W, et al, 1988, Scholer HR, et al, 1991). Protein ini dikarakterisasi dengan adanya domain yang mengikat DNA, yakni domain POU (Herr W, et al, 1988). Kebanyakan dari protein Oct-4 ini terekspresi dalam proses embriogenesis, hal ini mengindikasikan bahwa kemungkinan besar gen tersebut memegang peranan penting dalam mengatur perkembangan dan diferensiasi sel khususnya sel-sel embrio (Ruvkun G, et al., 1991, Ryan A.K, et al., 1997). Dalam proses perkembangan embrio, Oct-4 mulai terekspresi pada sel-sel pluripotent seperti pada tahap pembelahan blastomer, Inner Cell Mass (ICM) dari blastocit, epiblast dari embrio pada tahap postimplantasi, dan embrionik stem sel (ES) (Pesce M, et al, 2001., Yeom Yi, et al, 1991, Palmieri SL, et al, 1994). Pada saat dewasa, ekspresi Oct-4 hanya khusus ditemukan pada sel-sel germinal yang sedang berkembang (Pesce M, et al, 2000 dan 2001).
Ekspresi Oct-4 diyakini dapat dijadikan sebagai marker kunci untuk mengidentifikasi sel-sel yang pluripotent pada tikus, dan kemungkinan juga potensial untuk digunakan pada mamalia lainnya, karena gen Oct-4 memiliki homologi yang tinggi dengan ortholog Oct-4 pada hewan lain, baik dari susunan proteinnya maupun daerah pengaturannya (van Eijk MTJ, et al, 1999, Nordhoff V, et al, 2001). Sebuah penelitian yang mencoba menganggu fungsi Oct-4 pada tikus menyebabkan embrio yang dihasilkan kehilangan sifat pluripotent pada ICMnya (Nichols J, et al, 1998). Hal ini mengindikasikan bahwa Oct-4 dibutuhkan untuk mempertahankan sifat pluripotent sel. Lebih jauh sebuah penelitian yang mencoba menganalisa kuantitas ekspresi Oct-4 menunjukkan bahwa pada tingkatan ekspresi Oct-4 yang tinggi akan menyebabkan embrionik stem (ES) sel berkembang menjadi extra embrionik mesoderm atau endoderm, sedangkan pada tingkatan ekspresi yang rendah menyebabkan ES sel menjadi sel-sel tropectodermal. Sedangkan sel yang tingkatan ekspresi Oct-4nya normal akan tetap bersifat pluripoten (Niwa H, 2001, Niwa H, et al, 2000). Ini kembali mengindikasikan bahwa Oct-4 memegang peranan penting dalam mengatur pluripotensi dan diferensiasi sel, sehingga Oct-4 ini dapat dijadikan sebagai marker kunci untuk mengidentifikasi sel-sel yang bersifat pluripoten, atau totipoten (Pesce M, et al, 2000 & 2001).
Berdasarkan peranan gen Oct-4 yang demikian penting dalam proses pertumbuhan dan perkembangan terkhusus pada tahapan embrional, maka dalam makalah ini penulis akan berusaha untuk menguraikan struktur dan fungsi dari gen Oct-4, perbandingan pola ekspresinya dalam tahap embrional pada beberapa spesies yang berbeda serta pemanfaatannya dalam penelitian pertumbuhan dan perkembangan ternak.
Struktur dan Fungsi Oct-4Salah satu tanda utama dari kelompok gen faktor transkripsi POU adalah struktur domain POU yang terdiri dari dua subdomain struktural bebas yakni POU spesifik (POUs) yang terdiri atas 75 susunan asam amino yang spesifik gugus amino (N-terminal) dan POU homeodomain (POUh) yang terdiri atas 60 susunan asam amino gugus karboksil (C-terminal) (Gambar. 1) (Scholer HR, 1991). Kedua domain tersebut memiliki hubungan yang spesifik dengan DNA melalui struktur helix-turn-helix dan dihubungkan oleh variabel penghubung antara asam amino 15 sampai 56 (Klemm JD, et al, 1994). Daerah diluar domain POU tidak terlalu penting untuk pengikatan DNA dan nampaknya hanya sedikit sekuensnya yang terkonservasi. Pada gugus amino (N-Domain) kaya akan asam amino prolin, sedangkan pada gugus karboksil (C-Domain) kaya akan asam amino prolin, serin dan treonin (Scholer HR, 1991). Gugus amino telah lama diyakini berperan sebagai pengatur transaktivasi (Brehm A, et al, 1997), namun beberapa penelitian lain menunjukkan bahwa gugus karboksil juga memiliki peranan yang sama (Vigano, et al, 1996).
Salah satu stem sel yang paling banyak diteliti saat ini adalah Embrionik Stem sel (ES), ES berasal dari sel-sel embrio (khususnya sel-sel pada Inner Cell Mass/ICM) pada tahap blastocit yang kemudian dapat diisolasi untuk dikultur menjadi stem cel dan dikembangkan menjadi sel/jaringan atau organ baru. Kemampuan sel atau sebagian tubuh dari suatu organisme untuk berkembang menjadi sel apa saja (pluripotensi) atau menghasilkan kembali satu individu baru (totipotensi) telah lama menarik perhatian para ilmuan biologi selama beberapa generasi. Pada tingkatan molekuler, kemampuan pluripotensi atau totipotensi dari suatu sel (stem sel) sangat terkait dengan suatu faktor transkripsi dan ekspresinya dalam menentukan apakah sel tersebut akan bersifat totipotent, pluripotent atau hanya unipotent. Salah satu faktor transkripsi yang berperan penting dalam proses ini adalah gen Oct-4, yang juga dapat berfungsi mengaktifkan atau menekan ekspresi dari beragam gen.
Oct-4 adalah salah satu gen dalam kelompok POU domain (Pit1-Oct Unc86) yang berfungsi untuk memediasi pengaturan transkripsi dari gen target yang diikatkan pada urutan octamer pada daerah promotor atau enhancer (Scholer HR, 1991; Pesce M et al, 2001). Oct-4 adalah anggota kelas V dari kelompok POU faktor transkripsi (Scholer HR et al, 1990, Pesce M et al, 1999), dan biasanya juga dikenal dengan nama Oct-3 (Okamoto K et al, 1990). Gen Oct-4 ini merupakan salah satu gen yang paling banyak dikarakterisasi oleh peneliti saat ini karena gen ini berhubungan dengan sifat pluripotent dari sel-sel embrionik (Mitalipov., et al, 2003). Sebagai salah satu faktor transkripsi Oct-4 mengatur ekspresi gen target dengan mengikatkannya pada motif oktamer 5’-ATGCAAAT-3’ yang ada pada daerah promotor atau enhancernya (Scholer HR, et al, 1991, Herr W, et al, 1995, Pesce M, et al, 2001).
Protein dari gen ini telah berhasil diisolasi dari beragam organisme (Herr W, et al, 1988, Scholer HR, et al, 1991). Protein ini dikarakterisasi dengan adanya domain yang mengikat DNA, yakni domain POU (Herr W, et al, 1988). Kebanyakan dari protein Oct-4 ini terekspresi dalam proses embriogenesis, hal ini mengindikasikan bahwa kemungkinan besar gen tersebut memegang peranan penting dalam mengatur perkembangan dan diferensiasi sel khususnya sel-sel embrio (Ruvkun G, et al., 1991, Ryan A.K, et al., 1997). Dalam proses perkembangan embrio, Oct-4 mulai terekspresi pada sel-sel pluripotent seperti pada tahap pembelahan blastomer, Inner Cell Mass (ICM) dari blastocit, epiblast dari embrio pada tahap postimplantasi, dan embrionik stem sel (ES) (Pesce M, et al, 2001., Yeom Yi, et al, 1991, Palmieri SL, et al, 1994). Pada saat dewasa, ekspresi Oct-4 hanya khusus ditemukan pada sel-sel germinal yang sedang berkembang (Pesce M, et al, 2000 dan 2001).
Ekspresi Oct-4 diyakini dapat dijadikan sebagai marker kunci untuk mengidentifikasi sel-sel yang pluripotent pada tikus, dan kemungkinan juga potensial untuk digunakan pada mamalia lainnya, karena gen Oct-4 memiliki homologi yang tinggi dengan ortholog Oct-4 pada hewan lain, baik dari susunan proteinnya maupun daerah pengaturannya (van Eijk MTJ, et al, 1999, Nordhoff V, et al, 2001). Sebuah penelitian yang mencoba menganggu fungsi Oct-4 pada tikus menyebabkan embrio yang dihasilkan kehilangan sifat pluripotent pada ICMnya (Nichols J, et al, 1998). Hal ini mengindikasikan bahwa Oct-4 dibutuhkan untuk mempertahankan sifat pluripotent sel. Lebih jauh sebuah penelitian yang mencoba menganalisa kuantitas ekspresi Oct-4 menunjukkan bahwa pada tingkatan ekspresi Oct-4 yang tinggi akan menyebabkan embrionik stem (ES) sel berkembang menjadi extra embrionik mesoderm atau endoderm, sedangkan pada tingkatan ekspresi yang rendah menyebabkan ES sel menjadi sel-sel tropectodermal. Sedangkan sel yang tingkatan ekspresi Oct-4nya normal akan tetap bersifat pluripoten (Niwa H, 2001, Niwa H, et al, 2000). Ini kembali mengindikasikan bahwa Oct-4 memegang peranan penting dalam mengatur pluripotensi dan diferensiasi sel, sehingga Oct-4 ini dapat dijadikan sebagai marker kunci untuk mengidentifikasi sel-sel yang bersifat pluripoten, atau totipoten (Pesce M, et al, 2000 & 2001).
Berdasarkan peranan gen Oct-4 yang demikian penting dalam proses pertumbuhan dan perkembangan terkhusus pada tahapan embrional, maka dalam makalah ini penulis akan berusaha untuk menguraikan struktur dan fungsi dari gen Oct-4, perbandingan pola ekspresinya dalam tahap embrional pada beberapa spesies yang berbeda serta pemanfaatannya dalam penelitian pertumbuhan dan perkembangan ternak.
Struktur dan Fungsi Oct-4Salah satu tanda utama dari kelompok gen faktor transkripsi POU adalah struktur domain POU yang terdiri dari dua subdomain struktural bebas yakni POU spesifik (POUs) yang terdiri atas 75 susunan asam amino yang spesifik gugus amino (N-terminal) dan POU homeodomain (POUh) yang terdiri atas 60 susunan asam amino gugus karboksil (C-terminal) (Gambar. 1) (Scholer HR, 1991). Kedua domain tersebut memiliki hubungan yang spesifik dengan DNA melalui struktur helix-turn-helix dan dihubungkan oleh variabel penghubung antara asam amino 15 sampai 56 (Klemm JD, et al, 1994). Daerah diluar domain POU tidak terlalu penting untuk pengikatan DNA dan nampaknya hanya sedikit sekuensnya yang terkonservasi. Pada gugus amino (N-Domain) kaya akan asam amino prolin, sedangkan pada gugus karboksil (C-Domain) kaya akan asam amino prolin, serin dan treonin (Scholer HR, 1991). Gugus amino telah lama diyakini berperan sebagai pengatur transaktivasi (Brehm A, et al, 1997), namun beberapa penelitian lain menunjukkan bahwa gugus karboksil juga memiliki peranan yang sama (Vigano, et al, 1996).
Gen Oct-4 pada hewan mamalia memiliki tingkat homologi yang tinggi dengan ortholognya pada hewan yang lain, baik dari susunan protein maupun daerah pengaturannya (van Eijk MTJ, et al, 1999, Nordhoff V, et al, 2001). Urutan dan struktur, posisi serta daerah pengaturan ortholog gen Oct-4 pada manusia, tikus, monyet dan sapi sangat terkonservasi, hal ini juga mendasari anggapan bahwa fungsi dan pola ekspresi gen tersebut juga sangat terkonservasi. Ortholog gen Oct-4 pada sapi memiliki tingkat homologi di tingkatan protein dengan Oct-4 manusia dan tikus masing-masing 90.6% dan 81.7% (Nordhoff V, et al, 2001). Sedangkan persentase kesamaan (homologi) susunan asam amino mulai dari exon 1 sampai 5 antara Oct-4 sapi dengan tikus berturut-turut sebagai berikut 71.0%, 95.1%, 95.4%, 84.9%, dan 82.8% (van Eijk MTJ, et al, 1999). Hasil penelitian dari van Eijk MTJ, et al (1999) yang mengklon dan mengkarakterisasi ortholog Oct-4 pada sapi menunjukkan bahwa gen Oct-4 pada sapi memiliki panjang 3721 pb yang terdiri atas 5 exon dan 4 intron. Panjang exon 1, 2, 3, 4 dan 5 masing-masing : 405 pb, 121 pb, 131 pb, 159 pb, dan 267 pb sedangkan panjang Intron 1, 2, 3, dan 4 masing-masing 361 pb, 278 pb, 319 pb, dan 105 pb.
Sedangkan runutan asam-asam amino Oct-4 (bPou5f1) pada sapi (Bos taurus) berdasarkan hasil yang diperoleh dalam penelitian tersebut adalah sebagai berikut :
MAGHLASDFAFSPPPGGGGDGPGGPEPGWVDPRTWMSFQGPPGGSGIGPGVVPGAEV WGLPPCPPPYDLCGGMAYCAPQVGVGPVPPGGLETPQPEGEAGAGVESNSEGASPDP CAAPAGAPKLDKEKLEPNPEESQDIKALQKDLEQFAKLLKQKRITLGYTQADVGLTL GVLFGKVFSQTTICRFEALQLSFKNMCKLRPLLQKWVEEADNNENLQEICKAETLVQ ARKRKRTSIENRVRGNLESMFLQCPKPTLQQISHIAQQLGLEKDVVRVWFCNRRQKG KRSSSDYSQREDFEAAGSPFTGGPVSSPLAPGPHFGTPGYGGPHFTTLYSSVPFPEG EVFPSVSVTALGSPMHAN (van Eijk, MTJ, et al, 1999)
Dengan total asam amino sebanyak 360, Oct-4 pada sapi memiliki tingkat homologi sekitar 90.6% dengan manusia (Takeda J, et al, 1992) dan 81.7% dengan tikus (Okamoto K, et al 1990, Rosner MH, et al 1990, dan Scholer HR, et al 1990). Kemudian berdasarkan urutan asam amino dari exon 1 sampai exon 5, persentase homologi antara manusia dengan sapi adalah 84.4%, 97.5%, 100%, 94.3%, dan 89.7%. Sedangkan antara sapi dengan tikus dengan urutan yang sama masing-masing adalah 71.0%, 95.1%, 95.4%, 84.9% dan 82.8% (van Eijk MTJ, et al, 1999).
Dengan total asam amino sebanyak 360, Oct-4 pada sapi memiliki tingkat homologi sekitar 90.6% dengan manusia (Takeda J, et al, 1992) dan 81.7% dengan tikus (Okamoto K, et al 1990, Rosner MH, et al 1990, dan Scholer HR, et al 1990). Kemudian berdasarkan urutan asam amino dari exon 1 sampai exon 5, persentase homologi antara manusia dengan sapi adalah 84.4%, 97.5%, 100%, 94.3%, dan 89.7%. Sedangkan antara sapi dengan tikus dengan urutan yang sama masing-masing adalah 71.0%, 95.1%, 95.4%, 84.9% dan 82.8% (van Eijk MTJ, et al, 1999).
Berdasarkan fungsinya maka Oct-4 dapat digunakan sebagai marker pada sel-sel germinal (oocyte), sel-sel pluripoten serta pada perkembangan sel tumor. Fungsi dasar dari Oct-4 ini adalah menahan terjadinya diferensiasi sel, namun tetap membiarkan terproliferasi (pembelahan sel). Fungsi ini memungkinkan Oct-4 berfungsi mengatur pluripotensi sel. Kemampuan sel untuk tetap pada sifat pluripoten atau terdiferensiasi sangat tergantung pada tingkat ekspresi gen ini. Pada tingkat ekspresi di atas normal, maka sel akan terdiferensiasi menjadi endoderm atau mesoderm, sementara apabila tingkat ekspresinya dibawah normal maka sel akan kehilangan pluripotensinya dan terdiferensiasi menjadi tropectoderm (Niwa, H et al, 2000). Takahashi dan Yamanaka (2006) membuktikan bahwa bersama dengan gen Sox-2, c-MYC dan KLF4, gen Oct-4 dapat menyebabkan terdiferensiasinya sel-sel fibroblas.
Wearnig et al (2007) juga menunjukkan bahwa sel-sel yang diaktifkan kembali gen Oct-4 atau gen Nanognya secara epigenetik identik dengan stem sel. Kemudian dengan menggunakan 4 faktor transkripsi yaitu Oct-4, Sox2, KLF4, dan MYC, Park et al (2008) dapat menginduksi sifat pluripoten stem sel yang berasal dari sel fetus, bayi baru lahir, dan sel utama manusia termasuk fibroblasnya. Yu et al (2007) juga menunjukkan bahwa dengan menggunakan 4 faktor transkripsi yakni Oct-4, Sox2, Nanog dan LIN28, cukup untuk memprogram ulang sel-sel somatik manusia untuk menjadi stem sel pluripoten yang menunjukkan karakteristik yang sama dengan embrionik stem sel (ES). Demikian pula dengan hasil yang ditunjukkan oleh Liao J, et al (2008) yang menggunakan 6 faktor transkripsi yaitu Oct-4, Sox2, Nanog, LIN28, C-MYC dan KLF4 yang berhasil meningkatkan efisiensi induksi pluripotensi stem sel dari sel somatik manusia.
Pengaturan Ekspresi Oct-4
Telah dijelaskan sebelumnya bahwa, dengan kemampuannya untuk menjaga sifat pluripotensi sel, maka aktivitas Oct-4 harus diatur sedemikian ketatnya agar dapat dipastikan keberlanjutan sel-sel germinal dan ketepatan diferensiasi sel menjadi berbagai jaringan atau organ. Pada tikus, mRNA Oct-4 terdeteksi pada oocytes yang telah matang (Pesce M, et al, 1998). Pada tingkatan pembelahan 8 sel (morulla), ekspresi Oct-4 mencapai tingkatan yang jauh lebih tinggi. Sesudah itu, ekspresi Oct-4 hanya terbatas pada ICM, dan sedikit pada TE dan endoderm (Gambar. 4) (Palmieri S, et al, 1994). Kemudian dalam perkembangan embrio, ekspresi Oct-4 hanya ada pada Primordial Germ Cells (PGC) (Pesce M, et al, 1998). Hansis C, et al (2000 & 2001) menguji ekspresi Oct-4 pada blastosit manusia. ICM dan TE dari 17 blastosit manusia dipisahkan kemudian kadar mRNA Oct-4 secara tersendiri diuji dengan menggunakan RT-PCR. Hasilnya menunjukkan bahwa rata-rata ekspresi Oct-4 30 kali lebih tinggi di dalam sel-sel totipoten ICM dibandingkan dengan yang ada pada sel TE yang telah terdiferensiasi (Gambar. 4). Penelitian ini juga menunjukkan bahwa pola ekspresi Oct-4 pada tikus dan manusia sangat mirip.
Wearnig et al (2007) juga menunjukkan bahwa sel-sel yang diaktifkan kembali gen Oct-4 atau gen Nanognya secara epigenetik identik dengan stem sel. Kemudian dengan menggunakan 4 faktor transkripsi yaitu Oct-4, Sox2, KLF4, dan MYC, Park et al (2008) dapat menginduksi sifat pluripoten stem sel yang berasal dari sel fetus, bayi baru lahir, dan sel utama manusia termasuk fibroblasnya. Yu et al (2007) juga menunjukkan bahwa dengan menggunakan 4 faktor transkripsi yakni Oct-4, Sox2, Nanog dan LIN28, cukup untuk memprogram ulang sel-sel somatik manusia untuk menjadi stem sel pluripoten yang menunjukkan karakteristik yang sama dengan embrionik stem sel (ES). Demikian pula dengan hasil yang ditunjukkan oleh Liao J, et al (2008) yang menggunakan 6 faktor transkripsi yaitu Oct-4, Sox2, Nanog, LIN28, C-MYC dan KLF4 yang berhasil meningkatkan efisiensi induksi pluripotensi stem sel dari sel somatik manusia.
Pengaturan Ekspresi Oct-4
Telah dijelaskan sebelumnya bahwa, dengan kemampuannya untuk menjaga sifat pluripotensi sel, maka aktivitas Oct-4 harus diatur sedemikian ketatnya agar dapat dipastikan keberlanjutan sel-sel germinal dan ketepatan diferensiasi sel menjadi berbagai jaringan atau organ. Pada tikus, mRNA Oct-4 terdeteksi pada oocytes yang telah matang (Pesce M, et al, 1998). Pada tingkatan pembelahan 8 sel (morulla), ekspresi Oct-4 mencapai tingkatan yang jauh lebih tinggi. Sesudah itu, ekspresi Oct-4 hanya terbatas pada ICM, dan sedikit pada TE dan endoderm (Gambar. 4) (Palmieri S, et al, 1994). Kemudian dalam perkembangan embrio, ekspresi Oct-4 hanya ada pada Primordial Germ Cells (PGC) (Pesce M, et al, 1998). Hansis C, et al (2000 & 2001) menguji ekspresi Oct-4 pada blastosit manusia. ICM dan TE dari 17 blastosit manusia dipisahkan kemudian kadar mRNA Oct-4 secara tersendiri diuji dengan menggunakan RT-PCR. Hasilnya menunjukkan bahwa rata-rata ekspresi Oct-4 30 kali lebih tinggi di dalam sel-sel totipoten ICM dibandingkan dengan yang ada pada sel TE yang telah terdiferensiasi (Gambar. 4). Penelitian ini juga menunjukkan bahwa pola ekspresi Oct-4 pada tikus dan manusia sangat mirip.
Telah dijelaskan sebelumnya bahwa Oct-4 dapat berfungsi menekan atau mengaktifkan fungsi gen lain. Salah satu hal yang memungkinkan hal tersebut adalah kemampuan Oct-4 sebagai faktor transkripsi dan pengikat DNA (DNA Binding factor) melalui pengikatan gen target pada urutan octamer pada daerah promotor atau enhancer dari gen target. Oct-4 mengontrol ekspresi beberapa gen dalam awal pertumbuhan seperti gen FGF4, Sox-2, hCG, Utf-1, Opn, dan Esg-1 (Rosner MH, et al, 1990, Pesce M et al, 1999, Botquin V et al, 1998). Adapun mekanisme pengaturan Oct-4 terhadap gen-gen lain tersebut dapat bersifat langsung maupun tidak langsung (Pan, G.J et al, 2002). Oct-4 secara tidak langsung menekan fungsi gen melalui penetralan fungsi aktivator gen. Contoh pada gen FoxA1 atau A2 ditekan fungsinya melalui penetralan fungsi aktivator FoxD3 (Gambar. 5.1). Kemudian secara langsung Oct-4 dapat menekan fungsi gen lainnya melalui pengikatan Oct-4 pada motif octamer di daerah promotor gen ((Gambar. 5.2), atau mengaktifkan fungsi gen melalui pengikatan pada motif octamer di daerah promotor atau enhancer gen target bersama dengan faktor traskripsi lainnya seperti Sox-2 (Gambar. 5.3), melalui pembentukan protein Oct-4 adaptor (Gambar 5.4), atau secara langsung pengikatan Oct-4 pada motif octamer di daerah promotor gen target (Gambar 5.5). (Pan G.J et al, 2002).
Pola Ekspresi Oct-4 dalam Tahapan Embrional dari Beberapa Spesies yang Berbeda
Oct-4 telah lama diyakini sebagai salah satu gen yang berperan dalam proses embriogenesis. Terkait dengan hal tersebut beberapa peneliti telah lama mempelajari ekspresi Oct-4 pada tingkatan embrio. Hasil yang ditunjukkan oleh Yeom Yi, et al, (1991), dan Palmieri SL, et al (1994), bahwa Oct-4 terekspresi pada sel-sel pluripoten pada tahap pembelahan blastomer, Inner Cell Mass (ICM) dari blastocit, epiblast dari embrio pada tahap awal postimplantasi, dan embrionik stem sel. Kirchhof, et al (2000), kemudian melihat pola ekspresi Oct-4 pada preimplantasi embrio dari sapi, babi dan tikus dengan menggunakan gen reporter GFP (green fluorescent protein) dan menemukan pola ekspresi Oct-4 yang sama dari ketiga embrio, yakni pada awal blastocit, baik pada ICM maupun TE menunjukkan pola ekspresi Oct-4 (Gambar. 6)
Mitalipov, et al (2003), dengan menggunakan embrio monyet menemukan pola ekspresi yang sama bahwa Oct-4 pada oocit dan preimplantasi embrio monyet memiliki pola ekspresi yang sama pada tikus. Pada awal blastocit, baik pada ICM maupun TE menunjukkan pola ekspresi Oct-4, namun berkurang pada TE expanded blastocyt dan hilang pada hatched blastocyt. Sedangkan Kurosaka, et al (2004), dengan membandingkan pola ekspresi Oct-4 antara tikus dan sapi. Menemukan bahwa pada tahap 2, dan 4 sel, ekspresi Oct-4 tidak ditemukan pada tikus, namun pada tahap 8 sel baru terdeteksi namun pada level yang rendah. Hampir sama dengan yang ada pada embrio sapi, Oct-4 tidak ditemukan pada tahap 2, 4, dan 8 sel, namun pada embrio tahap 16 sel baru menunjukkan ekspresi. Pada tahap embrio morulla dan blastocit dari kedua hewan tersebut, Oct-4 meningkat dengan cepat dan berkurang pada TE dan akhirnya hanya terbatas pada ICM (Gambar. 7 dan 8).
Oct-4 telah lama diyakini sebagai salah satu gen yang berperan dalam proses embriogenesis. Terkait dengan hal tersebut beberapa peneliti telah lama mempelajari ekspresi Oct-4 pada tingkatan embrio. Hasil yang ditunjukkan oleh Yeom Yi, et al, (1991), dan Palmieri SL, et al (1994), bahwa Oct-4 terekspresi pada sel-sel pluripoten pada tahap pembelahan blastomer, Inner Cell Mass (ICM) dari blastocit, epiblast dari embrio pada tahap awal postimplantasi, dan embrionik stem sel. Kirchhof, et al (2000), kemudian melihat pola ekspresi Oct-4 pada preimplantasi embrio dari sapi, babi dan tikus dengan menggunakan gen reporter GFP (green fluorescent protein) dan menemukan pola ekspresi Oct-4 yang sama dari ketiga embrio, yakni pada awal blastocit, baik pada ICM maupun TE menunjukkan pola ekspresi Oct-4 (Gambar. 6)
Mitalipov, et al (2003), dengan menggunakan embrio monyet menemukan pola ekspresi yang sama bahwa Oct-4 pada oocit dan preimplantasi embrio monyet memiliki pola ekspresi yang sama pada tikus. Pada awal blastocit, baik pada ICM maupun TE menunjukkan pola ekspresi Oct-4, namun berkurang pada TE expanded blastocyt dan hilang pada hatched blastocyt. Sedangkan Kurosaka, et al (2004), dengan membandingkan pola ekspresi Oct-4 antara tikus dan sapi. Menemukan bahwa pada tahap 2, dan 4 sel, ekspresi Oct-4 tidak ditemukan pada tikus, namun pada tahap 8 sel baru terdeteksi namun pada level yang rendah. Hampir sama dengan yang ada pada embrio sapi, Oct-4 tidak ditemukan pada tahap 2, 4, dan 8 sel, namun pada embrio tahap 16 sel baru menunjukkan ekspresi. Pada tahap embrio morulla dan blastocit dari kedua hewan tersebut, Oct-4 meningkat dengan cepat dan berkurang pada TE dan akhirnya hanya terbatas pada ICM (Gambar. 7 dan 8).
Penutup
Oct 4 sebagai salah satu faktor transkripsi memegang peranan penting dalam proses embriogenesis terutama pada hewan mammalia terutama dalam menjaga sifat pluripotensi sel-sel embrio serta kemampuan untuk terdifferensiasinya sel-sel tersebut ke lapisan endoderm, mesoderm atau eksoderm sangat tergantung pada ada atau tidaknya regulasi dari Oct 4. Kemudian Oct-4 sebagai faktor transkripsi juga dapat menekan atau mengaktifkan fungsi gen lain dalam menunjukkan ekspresinya.
Gen Oct-4 memiliki tingkat homologi yang tinggi terutama dengan ortholog Oct-4 pada mammalia lainnya. Hal ini dapat dilihat dengan membandingkan tingkat homologi gen tersebut melalui perbandingan persentase susunan asam amino Oct-4 pada sapi dengan ortholognya pada manusia dimana tingkat homologi sekitar 90.6% dengan Oct-4 manusia dan 81.7% pada tikus. Hal ini membuktikan bahwa gen Oct-4 ini merupakan salah satu gen yang tingkat konservasinya cukup tinggi selama proses evolusi terjadi. Saat ini Oct-4 banyak diteliti dan dikarakterisasi seiring dengan berkembangnya teknologi stem sell terkait dengan peranan gen tersebut dalam menjaga sifat pluripotensi sel khususnya Embrionik Stem sel.
Oct 4 sebagai salah satu faktor transkripsi memegang peranan penting dalam proses embriogenesis terutama pada hewan mammalia terutama dalam menjaga sifat pluripotensi sel-sel embrio serta kemampuan untuk terdifferensiasinya sel-sel tersebut ke lapisan endoderm, mesoderm atau eksoderm sangat tergantung pada ada atau tidaknya regulasi dari Oct 4. Kemudian Oct-4 sebagai faktor transkripsi juga dapat menekan atau mengaktifkan fungsi gen lain dalam menunjukkan ekspresinya.
Gen Oct-4 memiliki tingkat homologi yang tinggi terutama dengan ortholog Oct-4 pada mammalia lainnya. Hal ini dapat dilihat dengan membandingkan tingkat homologi gen tersebut melalui perbandingan persentase susunan asam amino Oct-4 pada sapi dengan ortholognya pada manusia dimana tingkat homologi sekitar 90.6% dengan Oct-4 manusia dan 81.7% pada tikus. Hal ini membuktikan bahwa gen Oct-4 ini merupakan salah satu gen yang tingkat konservasinya cukup tinggi selama proses evolusi terjadi. Saat ini Oct-4 banyak diteliti dan dikarakterisasi seiring dengan berkembangnya teknologi stem sell terkait dengan peranan gen tersebut dalam menjaga sifat pluripotensi sel khususnya Embrionik Stem sel.
Daftar Pustaka
Botquin V., H. Hess., G. Fuhrmann., C. Anastassiadis., MK. Gross., G. Vriend., H.R. Scholer. 1998. New POU dimer configuration mediates antagonistic control of an osteopontin preimplantation enhancer by Oct-4 and Sox-2. Genes Dev. 12 : p. 2073-2090.
Brehm A, K. Ohbo, HR. Scholer. 1997. The carboxy-terminal transactivation domain of Oct 4 acquires cell specificity through the POU domain. Mol Cell Biol 17 : p. 154 – 162.
Hansis C, J. Grifo, L. Krey. 2000. Oct-4 expression in inner cell mass and trophectoderm of human blastocyts. Mol Hum Reprod. 6 : p. 999 – 1004.
Hansis C, Y. Tang, J. Grifo, L. Krey. 2001. Analysis of Oct-4 expression and ploidy in individual human blastomeres. Mol Hum Reprod 7 : p. 155 – 161.
Herr W, MA. Cleary. 1995. The POU Domain : versatility in transcriptional regulation by a flexible two in one DNA binding domain. Genes Dev. 9 : p. 1679 – 1693.
Herr W, RA. Sturm, RG. Clerc, LM. Corcoran, D. Baltimore, PA. Sharp, HA. Ingraham, MG. Rosenfeld, M. Finney, G. Ruvkun. 1988. The POU domain : a large conserved region in the mammalian pit-1, oct-1, oct-2, and Caenorhabditis elegans unc-86 gene product. Genes Dev. 2 : 1513 – 1516.
Kurosaka S, E. Sigrid, and K.J. McLaughlin. 2004. Pluripotent lineage definition in bovine embryos by Oct4 transcription localization. Biol Repro 71 : p. 1578 – 1582.
Kirchoff N., J.W. Carnwath., E. Lemme, K. Anastassiadis, H.R. Scholer, and H. Niemann. 2000. Expression pattern of Oct-4 in preimplantation embryos of different species. Biol Repro 63 : p. 1698 – 1705.
Klemm JD, MA. Rould, R. Aurora, W. Herr, CO. Pabo. 1994. Crystal structure of the Oct-1 POU domain bound to an octamer site : DNA recognition with tethered DNA-binding modules. 77 : p. 21 – 32.
Liao J., Z. Wu, Y. Wang, L. Cheng, C. Cui, Y. Gao, T, Chen, L. Rao, S. Chen, N. Jia, H. Dai, S. Xin, J. Kang , G. Pei, and L. Xiao. 2008. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research 18 : p. 600 – 603.
Mitalipov, M.S., K. Hung-Chih, J.D. Hennebold, and D.P. Wolf. 2003. Oct-4 expression in pluripotent cells of the rhesus monkey. Biol Repro vol. 69 : p. 1785 – 1792.
Nichols J, B. Zevnik, K. Anastassiadis, H. Niwa, D. Klewe-Nebenius, I. Chambers, HR. Scholer, A. Smith. 1998. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryos depends on the POU transcription factor Oct-4. Cell 95 : p. 379 – 391.
Niwa, I,H., J. Miyazaki, AG. Smith. 2000. Quantitative expression of Oct3/4 defines differentiation or self renewal of embryonic stem cell (ES). Nat Genet. 24 : p. 372 - 376.
Niwa H. 2001. Molecular mechanism to maintain stem cell renewal of ES cells. Cell Struct Funct. 26 : p. 271 – 278.
Nordhoff V, K. Hubner K, A. Bauer, I. Orlova, A. Malapesta, HR. Scholer. 2001. Comparative analysis of human, bovine, and murine Oct-4 upstream promoter sequences. Mamm Genome. 12 : p. 309 – 317.
Okamoto K, H. Okazawa, A. Okuda, M. Sakai, M. Muramatsu, H. Hamada. 1990. A novel octamer binding transcription factor is differentially expressed in mouse embryonic cells. Cell 60 : p. 461 – 472.
Palmieri S, W. Peter, H. Hess, HR. Scholer. 1994. Oct-4 transcription factor is differentialy expressed in the mouse embryo during establishment of the first extraembryonic cell lineages involved in implantation. Dev Biol 166 : p. 259 – 267.
Pan G.J, Z.Y. Chang, HR. Scholer, D. Pei. 2002. Stem cell pluripotency and transcription factor Oct-4. Cell Research 12 (5-6) : p. 321 – 329.
Park I.H., R. Zhao, J.A West, A. Yabuuchi, H. Huo, T.A Ince, P.H Lerou, M.W. Lensch, G.Q. Daley. 2008. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 451 : p. 141 – 146.
Pesce M, X Wang, D Wolgemuth, H. Scoler. 1998. Differensial expression of the Oct-4 transcription factor during mouse cell differentiation. Mech Dev. 71 : p. 89 – 98.
Pesce M, K. Anastassiadis, H.R. Scholer. 1999. Oct-4 : lessons of totipotency from embryonic stem cells. Cell Tissue Organ 165 : p. 144 – 152.
Pesce M, and H.R. Scholer. 2001. Oct-4 : gatekeeper in the beginning of mammalian development. Stem Cells 19 : p. 271 - 278.
Pesce M, and H.R Scholer. 2000. Oct-4 : control of totipotency and germline determination. Mol Rep Dev; 55 : p. 452 – 7.
Rosner MH., MA. Vigano., K. Ozato., PM. Timmons., F. Poirier., PW. Rigby., and LM. Staudt. 1990. A POU-domain transcription factor in early stem cells and germ cells of the mammalian embryo. Nature 345 : p. 686 – 692.
Ruvkun G, Finney M. 1991. Regulation of transcription and cell identity by POU domain protein. Cell 64 : p. 475 – 478.
Ryan AK, Rosenfeld MG. 1997. POU domain family values : flexibility, partnerships, and developemntal codes. Genes Dev. 11 : 1207 – 1225.
Takeda J, S. Seino, G. Bell. 1992. Human Oct3 gene family : cDNA sequences, alternate splicing, gene organization, chromosomal location, and expression at low levels in adult brain. 20 : p. 4613 – 4620.
Scholer H.R, S. Ruppert, N. Suzuki, K. Chowdhury, P. Gruss. 1990. New Type of POU domain in germ line-specific protein Oct-4. Nature 344 : p. 435 – 439.
Scholer, H.R. 1991. Octamania : the POU factors in murine development. Trends Genet. 7 : p. 323-329.
Takahashi, K., S. Yamanaka. 2006. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126 : p. 663 - 676.
van Eijk, M.J.T., M.A. van Rooijen, S. Modina, L. Scesi, G. Folkers, H.T.A. van Tol, M.M. Bevers, S.R. Fisher, H.A. Lewin, D. Rakacolli, C. Galli, C. de Vaureix, A.O. Trounson, C.L. Mummery and F. Gandolfi. 1999. Molecular cloning, genetic mapping, and developmental expression of bovine POU5F1. Biol Repro 60 : 1093 – 1103.
Vigano MA, and LM. Staudt. 1996. Transcriptional activation by Oct-3. Evidence for a specific role of the POU-specific domain in mediating functional interaction with oct-1. Nucleic Acids Res. 24 : p. 2112
Wernig M, A. Meissner, R. Foreman, T. Brambrink, M. Ku, K. Hochedlinger, BE. Bernstein, R. Jaenisch. 2007. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature 448 : p. 318 – 324.
Yeom Y, HS. Ha, R. Bailing, HR. Scholer, K. Artzt. 1991. Structure, expression, and chromosomal location of the Oct-4 gene. Mech Dev. 35 : p. 171 – 179.
Yu, J., M.A Vodyanik, K. Smuga-Otto, R, Foreman, J. Antosiewicz-Bourget, J.L Frane, S. Tian, J, Nie., G.A Jonsdottir, V. Ruotti, R. Stewart, I.I Slukvin and J.A. Thomson. 2007. In vitro reprogramming of fibroblast into pluripotent ES cell-like state. Nature 448 : p. 318 - 324.
Botquin V., H. Hess., G. Fuhrmann., C. Anastassiadis., MK. Gross., G. Vriend., H.R. Scholer. 1998. New POU dimer configuration mediates antagonistic control of an osteopontin preimplantation enhancer by Oct-4 and Sox-2. Genes Dev. 12 : p. 2073-2090.
Brehm A, K. Ohbo, HR. Scholer. 1997. The carboxy-terminal transactivation domain of Oct 4 acquires cell specificity through the POU domain. Mol Cell Biol 17 : p. 154 – 162.
Hansis C, J. Grifo, L. Krey. 2000. Oct-4 expression in inner cell mass and trophectoderm of human blastocyts. Mol Hum Reprod. 6 : p. 999 – 1004.
Hansis C, Y. Tang, J. Grifo, L. Krey. 2001. Analysis of Oct-4 expression and ploidy in individual human blastomeres. Mol Hum Reprod 7 : p. 155 – 161.
Herr W, MA. Cleary. 1995. The POU Domain : versatility in transcriptional regulation by a flexible two in one DNA binding domain. Genes Dev. 9 : p. 1679 – 1693.
Herr W, RA. Sturm, RG. Clerc, LM. Corcoran, D. Baltimore, PA. Sharp, HA. Ingraham, MG. Rosenfeld, M. Finney, G. Ruvkun. 1988. The POU domain : a large conserved region in the mammalian pit-1, oct-1, oct-2, and Caenorhabditis elegans unc-86 gene product. Genes Dev. 2 : 1513 – 1516.
Kurosaka S, E. Sigrid, and K.J. McLaughlin. 2004. Pluripotent lineage definition in bovine embryos by Oct4 transcription localization. Biol Repro 71 : p. 1578 – 1582.
Kirchoff N., J.W. Carnwath., E. Lemme, K. Anastassiadis, H.R. Scholer, and H. Niemann. 2000. Expression pattern of Oct-4 in preimplantation embryos of different species. Biol Repro 63 : p. 1698 – 1705.
Klemm JD, MA. Rould, R. Aurora, W. Herr, CO. Pabo. 1994. Crystal structure of the Oct-1 POU domain bound to an octamer site : DNA recognition with tethered DNA-binding modules. 77 : p. 21 – 32.
Liao J., Z. Wu, Y. Wang, L. Cheng, C. Cui, Y. Gao, T, Chen, L. Rao, S. Chen, N. Jia, H. Dai, S. Xin, J. Kang , G. Pei, and L. Xiao. 2008. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research 18 : p. 600 – 603.
Mitalipov, M.S., K. Hung-Chih, J.D. Hennebold, and D.P. Wolf. 2003. Oct-4 expression in pluripotent cells of the rhesus monkey. Biol Repro vol. 69 : p. 1785 – 1792.
Nichols J, B. Zevnik, K. Anastassiadis, H. Niwa, D. Klewe-Nebenius, I. Chambers, HR. Scholer, A. Smith. 1998. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryos depends on the POU transcription factor Oct-4. Cell 95 : p. 379 – 391.
Niwa, I,H., J. Miyazaki, AG. Smith. 2000. Quantitative expression of Oct3/4 defines differentiation or self renewal of embryonic stem cell (ES). Nat Genet. 24 : p. 372 - 376.
Niwa H. 2001. Molecular mechanism to maintain stem cell renewal of ES cells. Cell Struct Funct. 26 : p. 271 – 278.
Nordhoff V, K. Hubner K, A. Bauer, I. Orlova, A. Malapesta, HR. Scholer. 2001. Comparative analysis of human, bovine, and murine Oct-4 upstream promoter sequences. Mamm Genome. 12 : p. 309 – 317.
Okamoto K, H. Okazawa, A. Okuda, M. Sakai, M. Muramatsu, H. Hamada. 1990. A novel octamer binding transcription factor is differentially expressed in mouse embryonic cells. Cell 60 : p. 461 – 472.
Palmieri S, W. Peter, H. Hess, HR. Scholer. 1994. Oct-4 transcription factor is differentialy expressed in the mouse embryo during establishment of the first extraembryonic cell lineages involved in implantation. Dev Biol 166 : p. 259 – 267.
Pan G.J, Z.Y. Chang, HR. Scholer, D. Pei. 2002. Stem cell pluripotency and transcription factor Oct-4. Cell Research 12 (5-6) : p. 321 – 329.
Park I.H., R. Zhao, J.A West, A. Yabuuchi, H. Huo, T.A Ince, P.H Lerou, M.W. Lensch, G.Q. Daley. 2008. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 451 : p. 141 – 146.
Pesce M, X Wang, D Wolgemuth, H. Scoler. 1998. Differensial expression of the Oct-4 transcription factor during mouse cell differentiation. Mech Dev. 71 : p. 89 – 98.
Pesce M, K. Anastassiadis, H.R. Scholer. 1999. Oct-4 : lessons of totipotency from embryonic stem cells. Cell Tissue Organ 165 : p. 144 – 152.
Pesce M, and H.R. Scholer. 2001. Oct-4 : gatekeeper in the beginning of mammalian development. Stem Cells 19 : p. 271 - 278.
Pesce M, and H.R Scholer. 2000. Oct-4 : control of totipotency and germline determination. Mol Rep Dev; 55 : p. 452 – 7.
Rosner MH., MA. Vigano., K. Ozato., PM. Timmons., F. Poirier., PW. Rigby., and LM. Staudt. 1990. A POU-domain transcription factor in early stem cells and germ cells of the mammalian embryo. Nature 345 : p. 686 – 692.
Ruvkun G, Finney M. 1991. Regulation of transcription and cell identity by POU domain protein. Cell 64 : p. 475 – 478.
Ryan AK, Rosenfeld MG. 1997. POU domain family values : flexibility, partnerships, and developemntal codes. Genes Dev. 11 : 1207 – 1225.
Takeda J, S. Seino, G. Bell. 1992. Human Oct3 gene family : cDNA sequences, alternate splicing, gene organization, chromosomal location, and expression at low levels in adult brain. 20 : p. 4613 – 4620.
Scholer H.R, S. Ruppert, N. Suzuki, K. Chowdhury, P. Gruss. 1990. New Type of POU domain in germ line-specific protein Oct-4. Nature 344 : p. 435 – 439.
Scholer, H.R. 1991. Octamania : the POU factors in murine development. Trends Genet. 7 : p. 323-329.
Takahashi, K., S. Yamanaka. 2006. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126 : p. 663 - 676.
van Eijk, M.J.T., M.A. van Rooijen, S. Modina, L. Scesi, G. Folkers, H.T.A. van Tol, M.M. Bevers, S.R. Fisher, H.A. Lewin, D. Rakacolli, C. Galli, C. de Vaureix, A.O. Trounson, C.L. Mummery and F. Gandolfi. 1999. Molecular cloning, genetic mapping, and developmental expression of bovine POU5F1. Biol Repro 60 : 1093 – 1103.
Vigano MA, and LM. Staudt. 1996. Transcriptional activation by Oct-3. Evidence for a specific role of the POU-specific domain in mediating functional interaction with oct-1. Nucleic Acids Res. 24 : p. 2112
Wernig M, A. Meissner, R. Foreman, T. Brambrink, M. Ku, K. Hochedlinger, BE. Bernstein, R. Jaenisch. 2007. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature 448 : p. 318 – 324.
Yeom Y, HS. Ha, R. Bailing, HR. Scholer, K. Artzt. 1991. Structure, expression, and chromosomal location of the Oct-4 gene. Mech Dev. 35 : p. 171 – 179.
Yu, J., M.A Vodyanik, K. Smuga-Otto, R, Foreman, J. Antosiewicz-Bourget, J.L Frane, S. Tian, J, Nie., G.A Jonsdottir, V. Ruotti, R. Stewart, I.I Slukvin and J.A. Thomson. 2007. In vitro reprogramming of fibroblast into pluripotent ES cell-like state. Nature 448 : p. 318 - 324.
wah.....ni makalahnya bapak yah.......
BalasHapus